中心拥有一流完善的研究开发设备320余台套,建有细胞、基因、蛋白质、发酵、制剂工程等5个标准化实验室和1个检测中心,拥有了30项优势技术、10个标准化操作平台,可为国内外客户提供从基因到蛋白纯化的整套技术服务。
1.蛋白表达服务
1.1重组蛋白原核表达服务(大肠杆菌系统)
利用生物信息学软件 分析稀有密码子 、 蛋白亲水性和跨膜结构域 ,对基因进行 密码子优化 和片段设计;通过多种载体组合使其尽可能的 分泌表达 ,形成 接近天然构象的重组蛋白 ;并通过 多种规模蛋白发酵模式(500ml、 1L、5L、 10L) 获得 高纯度 的 毫克级重组蛋白 ( LAL检测法低内毒素<0.1EU/ug )。
表1 重组蛋白原核表达服务项目
序号 |
类别 |
服务内容 |
1 |
全基因合成 |
包含目的基因合成与亚克隆,可选择的表达载体以pET和pGEX系列为主。 服务周期:2-3周。 |
2 |
原核蛋白表达及纯化 |
包括 E.coli 表达菌株转化、筛选、表达和纯化,可选择的表达菌株:BL21 (DE3)、Rosetta-gami (DE3)、OrigamiB (DE3)、Rosetta (DE3)等。 服务周期:3-4周。 |
表2 可选标签
序号 |
标签 |
纯化条件 |
1 |
Poly-Arg |
0.80kDa,阳离子交换树脂,NaCl线性洗脱(0–400 mM) |
2 |
Poly-His |
0.84kDa,Ni 2+ 琼脂柱,20–250 mM咪唑/低pH |
3 |
FLAG |
1.01kDa,FLAG抗体亲和琼脂柱,2–5 mM EDTA |
4 |
Strep-tag II |
1.06kDa,链亲和素,2–25 mM脱硫生物素 |
5 |
c-myc |
1.20kDa,myc抗体亲和琼脂柱,低pH |
6 |
S-tag |
1.75kDa,S蛋白琼脂柱,3 M异硫氰酸; 0.2 M柠檬酸钾, pH 2或3 M MgCl 2 |
7 |
Fh8 |
8.0kDa,Ca 2+ 依赖性 苯基琼脂糖凝胶,10 mM EDTA |
8 |
Trx |
11.7kDa,4氨基氧化苯胂琼脂凝胶柱,5–1000mM 2-巯基乙醇 |
9 |
SUMO |
12.0kDa,亲和标签纯化(His) |
10 |
BRT17 |
14.7kDa,25–75 mM Ca2+溶液沉淀 |
11 |
GST |
26.0kDa,谷胱甘肽琼脂柱,10–20 mM还原谷胱甘肽 |
12 |
HaloTag7 |
34.0kDa,氯烷烃配体琼脂柱,带标签挂柱蛋白酶裂解 |
13 |
MBP |
42.5kDa,交联支链淀粉,10 mM麦芽糖 |
14 |
ELPs |
47.0kDa,高浓度NaCl (>1.5 M)或温度转变方式 |
15 |
NusA |
54.8kDa,亲和标签纯化(His) |
1.2重组蛋白酵母表达服务
表3 重组蛋白酵母表达服务 项目
序号 |
类别 |
服务内容 |
1 |
酵母表达载体亚克隆
|
密码子优化,基因合成(或客户提供质粒模板:目的基因扩增) 将目标基因亚克隆到合适的表达质粒上,可提供表达载体,如pPICZaA 、pGAPZaA、pPIC9K 拼接序列验证:测序 交付:正确构建的重组表达质粒,含重组质粒的DH5α菌株及测序原始报告 |
2 |
酵母表达菌株转化 |
可提供表达菌株:X33,GS115,酿酒酵母等。 扩增培养5-10个阳性克隆并进行重组蛋白诱导表达 SDS-PAGE交付:阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。 |
3 |
酵母表达菌株筛选 |
检测重组蛋白表达情况(适用于多拷贝数和高表达菌株) 交付:阳性克隆菌株及表达筛选结果报告。 |
4 |
酵母表达菌株表达优化 |
对挑选出来的单克隆菌株,优化培养及诱导条件(培养基,菌体密度,甲醇浓度,诱导时间等),提高目标蛋白的表达量 |
5 |
小规模蛋白表达及纯化 |
1L发酵液通过亲和,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化表达的重组蛋白。 SDS-PAGE交付:重组蛋白0.02-3mg及纯化报告。可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度>85%。 |
6 |
大规模蛋白表达及纯化 |
10L,30L,80L,130L,500L发酵规模 |
7 |
增值服务 |
通过HPLC,质谱等方法详细检测目标蛋白的质量。 蛋白质N端测序:PPSQ31(Edman降解法测序仪) |
2. 蛋白质 纯化服务
多年来致力于蛋白表达与纯化的相关研究,拥有综合性的蛋白纯化技术、多种纯化体系,能够提供多元化的蛋白纯化方案。仅GE纯化基质已有十多种,能同时大规模、扫描式的进行蛋白纯化和分离工作,节省客户宝贵的科研时间,以高质量满足客户需求。月入百万的游戏代理可提供定制的蛋白纯化服务包括,有/无标签重组蛋白,天然蛋白的纯化分离等。根据蛋白性质设计亲和纯化、离子交换、分子筛、疏水等多种蛋白纯化实验方案,获得的高纯度蛋白质,可根据客户需求一对一进行个性化方案定制,能够满足蛋白质折叠、重结晶等一系列精细实验要求。
表4 常规纯化项目
序号 |
类别 |
服务内容 |
1 |
凝胶过滤层析 |
根据分子间的大小或者形状差异进行分离,特别适用于分离相对分子质量大于2000的高分子化合物和相对分子质量差异大的混合物及低聚物。 |
2 |
离子交换层析 |
根据蛋白质分子表面静电荷的差异进行分离,阳离子交换主要是改变pH,主要应用于等电点大于5的蛋白质;阴离子交换主要是改变盐浓度,适用于大部分蛋白质,除杂能力较强,对热源质、核酸、外毒素及电荷性有差别的蛋白效果显著。 |
3 |
疏水层析 |
根据蛋白质与疏水吸附剂之间的疏水作用差异进行分离,适用范围广,原则上可用于所有蛋白质的纯化,适合于从大体积中提取低含量的目标蛋白,对DNA及小牛血清去除率较高。 |
4 |
亲和层析 |
根据生物活性物质与特异性配体间的特异性亲和力来达到分离目的,适用于抗原抗体亲和纯化,以及一系列标签纯化。 |
表5 亲和纯化项目
序号 |
类别 |
服务内容 |
1 |
HIS Tag |
一般为6-8个组氨酸组合,标签小,纯化简单;能与其他标签形成双标签;能纯化可溶性/包涵体蛋白。组氨酸残基上的咪唑基团可与层析介质中的金属离子螯合,再通过提高缓冲液中咪唑浓度进行竞争性洗脱达到纯化效果。 |
2 |
GST Tag |
26KD,可溶性标签,提高蛋白表达的可溶性;不能应用于包涵体等需变形处理的纯化;利用GST融合蛋白与固定的谷胱甘肽(GSH)通过硫键共价亲和,通过GSH交换洗脱原理来进行纯化。 |
3 |
Flag Tag |
8个氨基酸DYKDDDDK,在真核表达系统中表达效率更高; 可以纯化有活性的融合蛋白,琼脂糖上偶联有flag抗体,可采用竞争性洗脱或酸性洗脱。 |
4 |
MBP Tag |
42.5 KD,多糖树脂吸附,可以减少目标蛋白的降解,增加蛋白的表达量和稳定性,提高表达产物的水溶性,但标签较大,对蛋白的结构和功能会有一定影响。适用于包涵体的纯化。 |
5 |
Strep Tag |
8个氨基酸WSHPQFEK,生物素(biotin)和抗生物素蛋白链菌素(streptavidin)之间的结合反应。纯化流程温和能保持目标蛋白活性;能进行变性条件下的纯化;价格相对HIS Tag而言较高。 |
表6 天然蛋白纯化服务项目
序号 |
类别 |
服务内容 |
1 |
天然大分子蛋白分离纯化 |
选用适当孔径的分子筛分离纯化,配合使用阴、阳离子吸附柱以及HLPC,鉴定并收取相应洗脱峰。 |
2 |
天然小分子蛋白分离纯化 |
多层级分离过滤配合分子筛去除大分子杂质,结合使用大孔树脂或反向树脂纯化小分子蛋白,经 HPLC和MS鉴定纯化。 |
3 |
混合未知蛋白样品分离纯化 |
由卡梅德生物制定相应方案进行分离纯化,并经质谱鉴定、活性鉴定等多种方案确认分离产物。 |
表7 重组蛋白纯化服务项目
序号 |
类别 |
服务内容 |
1 |
重组蛋白脱标签及分离纯化 |
商品化亲和纯化树脂,如Ni柱,GST-Beads等分离纯化带有6xHis、GST、SUMO、MBP融合蛋白,获得纯度90%以上融合蛋白 |
2 |
不含标签的重组蛋白纯化 |
抗体亲和纯化;也可选择类似于天然蛋白纯化方式,依项目而定 |
3 |
包涵体变性与复性纯化 |
根据蛋白质不同的性质,可以选择尿素、盐酸胍、去垢剂、极端pH等,以保证最大程度获得单体状态的变性蛋白 |
3.特色表达服务
中心可根据 客户提供 的 目的基因或基因序列,交付质粒DNA、表达菌株、纯度90%以上的重组蛋白质和表达产物检测报告。检测报告主要包括测序报告、实验条件、SDS-PAGE报告和COA等。
3.1 基因合成及密码子优化(可选) : 基因序列通过密码子优化后,蛋白表达量可提高几倍至数十倍。
3. 2载体构建 : 包括IPTG,阿拉伯糖,热休克,冷休克诱导方式,GST,Trx,SUMO,BMP,His,HA,Flag,myc等融合标签载体的构建。提供客户正确构建的重组表达质粒。
3. 3表达菌株筛选 : 将表达质粒转化到高效的E. coli表达菌株中。SDS-PAGE电泳检测,挑选合适的单克隆菌株用于目标蛋白的表达。可提供表达菌株:DH5α, Top10, BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLys, Golden, Rosetta(DE3), RosettaBlue(DE3),Rosetta gami B (DE3), C41等宿主。提供客户含重组质粒的表达菌株。
3. 4蛋白表达及纯化 : 诱导表达目标蛋白。通过亲和层析,离子交换,疏水及凝胶过滤等多种层析方法纯化目的蛋白;可根据需求切除标签,再纯化获得目标蛋白。提供客户纯化后的目标蛋白,可按客户要求提供含纯化标签(Tag)或切除纯化标签(Tag)的最终蛋白,纯度根据客户要求可达95%以上甚至更高。
3. 5包涵体复性 : 蛋白诱导表达与包涵体纯化,数百种缓冲条件快速筛选最佳复性缓冲,采用稀释复性,透析复性,柱层析复性等多种技术获得纯度大于90%的包涵体。
3. 6蛋白大规模制备 : 如果想要纯化获得克级蛋白,需要使用发酵罐发酵获得上百克到公斤级的菌体, 中心 提供成熟的发酵罐发酵平台进行大肠杆菌或者酵母菌的高密度发酵。 其中, 5L 小罐发酵(2.5L工作体积),周期2周 ; 50L 大罐发酵(25L 工作体积),一般可收获1Kg左右菌体,周期2周 。
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